10个方面保证16S微生物组研究中最佳一致性

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　葿膄

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　肂袃

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　膃衿

　膁螂

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　螀袂

　袈莄

　蚃莈

　肅膂

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　10个方面保证

　16S微生物组研究中的最佳一致性

　失之毫厘，谬以千里。这句话用在百变的微生物组研究中最正确不过了。下面结合取样、样品存储、

　DNA提取、文

　库准备、测序和分析等

　10个关键因素说说，如何系统和周

　到的在现有技术下保证

　16S微生物组研究中的最佳一致性？

　全文约3800字，建议阅读时间

　7分钟。

　样本采集1、采样点：不一致的采样点可能会引起微生物群落变化，比如：胃肠道、呼吸道的不同部位，不同的土壤深度等。2、采集方法：不同样本采集方法、非侵入性／较少侵入性的方法能否替代侵入性采集方法说法不一。例如，研究显示，人肠道拭子和活检标本、呼出气冷凝液和肺刷、经口留置胃管和瘘管采样菌群差异显著；牛瘤胃的一项研究则显示，不同的采样方法差别不大；另外，鼻拭子和活检样本、直肠拭子和粪便样本菌群组成又差异不大了。缺乏共识和标准化的情况下，采集方法的一致性和预实验就十分重要了。

　3、均匀度：重要的事说三遍，混匀！混匀！混匀！尤其在

　肠道、土壤等高复杂或大尺度采样时。

　Note：参考已有／文献中数据时，

　首先看采样方法是否一致，

　尽量避免来自不同采样方法的数据的比较。同一项目的待比

　数据尽量保证采集条件、标准和方法的一致性。

　样品存储新鲜样本、直接提取时最好的选择，如果不能，

　最权威的做法无疑是快速冷冻到

　-80

　

　度。新鲜

　VS

　

　冷冻样本：

　两项研究表明，冷冻样本中

　F/B

　明显升高。

　Fouhyetal

　的研

　究显示，冷冻的影响只到属，

　门、纲水平群落无甚差异。

　DNA

　提取前把粪便样本冷藏个

　24h

　或

　72h，微生物组成和多样性

　都不会造成太大差异。

　Lauber等在不同温度下储存土壤、粪便和皮肤样本，发现储存时间对菌群结构和多样性没有显著影响。－

　80oC存储2

　年，群落变化很小，仅OTU数目减少，lactobacilliandbacilli丰度略有增加。

　Note：最好新鲜样本即时处理，如若不行，可以按不同保存

　时间等设置不同批次，处理方法、存储时间和

　DNA提取批

　次的记录很重要。

　03使用保护剂McKain等人探讨了使用低温保护剂(即甘油/磷酸盐缓冲液)来存储瘤胃样品的效果，qPCR发现，没有使用冷冻保护剂的冷冻样品存在拟杆菌的显著损失。

　Choo等人比较了使用几种常用保护剂

　(即RNAlater,

　OMNIgene.GUT

　和Tris-EDTA)和-80oC直接干燥冻存的粪便

　样品的菌群分布，发现OMNIgene.GUT

　效果最好、差异最小；

　Tris-EDTA处理组发现一些重要的细菌类型如

　Escherichia-Shigella,Citrobacter

　和Enterobacter发生了显著

　改变；效果最差的是

　RNAlater，菌群结构发生剧烈变化。

　Note：选用保护剂保存样本时，十分重要的是，所有样本的处理一致（选用同一种保护剂）

　。

　04DNA提取可能影响提取和下游

　PCR实验的原因包括：

　1、

　某些难于裂解的微生物细胞，包括细菌内生孢子和革兰氏阳

　性菌等，影响提取效率。

　2、抑制剂（来自环境、土壤、粪便中的残骸、有机物等）

　可影响下游

　PCR效率，常见的抑制剂主要是有机质

　（如腐植

　酸、胆汁酸盐和多糖等）和一些无机质（如钙离子）

　。

　提取方法上，手提最经典的方法就是酚

　-氯仿提取法。此外，

　适用于各种样本类型的商用试剂盒也非常丰富，这里不多介

　绍。值得注意的是，很多文献都显示，不同的提取方法可能

　引发微生物群落的剧烈变化。

　Note：所有样本的提取尽量采用一致的方法，在保证特定物

　种成功提取的情况下尽可能的提高产量和质量。得率的优化

　可以从核心步骤

　beadbeating开始，建议预先优化整体

　protocol。

　文库构建1、区域和引物选择：基于主流测序平台，目前

　常见的16SrRNA测序区域选择以

　V4（适用于2X250测序）

　和V34（适用于2X300测序）等为主，然而事实上，没有哪种引物是真正通用的，多项不同区域的比较研究给出了各种

　各样的结论。值得注意的是，针对特定关注的微生物类型，也可以选择一些特定的区域扩增。不同引物可能导致相对丰

　度和物种丰富度的改变，进而改变微生物群落结构。

　2、PCR循环数：降低

　PCR循环数可以减少嵌合体的产生。

　3、高保真聚合酶：不同的聚合酶对特定细菌群和整体细菌

　群落结构有显著影响。

　4、起始DNA量：PCR反应的起始

　DNA总量也可能影响细

　菌群落结构。

　Note：16S测序中并没有真正的“金标准”，重要的是选择尽量适合的引物，考虑到PCR试剂和PCR条件的优化，并在

　研究中保持一致。

　06测序平台454：事实上在很长一段时间里，

　Roche454是

　文献和微生物组计划们

　（如HMP）最常见的选择平台，

　虽然

　有同聚物的错误，但是速度读长

　OK，一度独领风骚。然而

　通量小、成本高，逐渐退出竞争链。

　illumina：目前最主流的选择，其中又以

　MiSeq平台更为适用。16Smetabarcoding的特点决定了其对读长的要求，是以目前市场上主要服务的机

　型并不是大热的

　HiSeqX或NovaSeq，而是相对面世更早、

　读长更长的

　MiSeq(2X300)和HiSeq2500(2X250)。

　Pacbio：Pacbio和下面的Nanopore为微生物组研究带来的希

　望是，无需头疼选择好的扩增区域了，超长读长使常规

　16SV1-V9区可以全测通，其他功能微生物的可扩增和鉴定

　范围也进一步拓展。

　Pacbio目前的配套建库、生信分析工具

　日趋成熟，陆续有文章证实技术的可靠性。然成本过高，在

　某些程度上限制了应用范围，目前已在逐渐降低成本。

　Nanopore：号称使长至天际的测序仪，读长优势也很明朗。

　但是错误率偏高，新技术文章积累不足，实验、测序到信息

　分析的普及程度仍需发展。

　计划开展

　16S

　

　测序（注意只是

　测序）时，需要考虑

　4个关键因素：

　1、数据质量

　2、测序成本

　3、测序读长

　

　4、每个

　

　run

　

　可以测

　序的样本数量

　Note:应根据实验目标、

　错误率、测序覆盖率和样本数量的关

　系等选择合适的测序平台。例如，主要研究群落中的核心物

　种，那么就可以通过增加样本数量来降低一个

　run中每个样

　本的覆盖率进而降低成本，如果稀有物种则反之。

　模拟细菌群落1、MockCommunities：已知比例的预混合细菌群落是一个很好的量化误差的方法。模拟群落可以从美国标准菌库（ATCC）或ZymoResearch获得。2、Spike-in

　standards：在每个样本中添加标准物，以在单样本基础上进

　行质量控制。为防止与样本序列存在交叉，此处要选择不太

　可能出现在感兴趣样本中的细菌，或者

　insilico设计的和数

　据库中有差异的序列。

　Note：推荐！

　分析策略流程和分解步骤的分析软件和数据库，在之前的文章中做过详细解释和点评

　,?9个模块＋40余款软件＋

　老司机辣评

　|16S信息分析流程软件和数据库合集。这里补

　充一项，基因拷贝数校正：

　不同的细菌类型

　16SrRNA基因拷贝数有所不同，想要准确

　获知真实的拷贝数信息比较难。

　但是，目前已经有一些工具，

　可以利用序列数据库和系统遗传信息来校正拷贝数变化。其

　中包括Copyrighter、rrNDB、picanteR包和pplace中的函数，

　以及功能预测工具

　PICRUSt也包含有拷贝数校正的功能。

　然而，既然是基于数据库，那么，考虑到数据库中的信息数

　量，仍然是不够全面的。

　09污染问题DNA提取试剂盒、PCR试剂和实验室环境中产

　生的微生物

　DNA污染在研究低微生物量样品时可能会造成

　非常严重的影响。

　1、阴性对照（或仅仅只有试剂）可以比

　较好的发现问题。

　2、处理之前的随机抽样可能有助于减少此类问题发生。

　具体的解决污染的方法：

　1、去除PCR试剂背景污染物的扩增：

　Primer-extension

　PCR(对其他来源污染没有影响

　)

　2、去除试剂和实验室环境中的DNA污染：紫外线和γ辐射、酶处理、硅基膜过滤、CsCl2密度梯度离心法、漂白剂/CoPA溶液处理等。

　Note：想要开展靠谱的

　16S研究，建议包含

　reagent-only

　controls（例如，DNA提取试剂盒和

　PCR控制）。

　10模拟细菌群落

　1、MockCommunities：已知比例的预混合

　细菌群落是一个很好的量化误差的方法。模拟群落可以从美

　国标准菌库（ATCC）或ZymoResearch获得。2、Spike-in

　standards：在每个样本中添加标准物，以在单样本基础上进

　行质量控制。为防止与样本序列存在交叉，此处要选择不太

　可能出现在感兴趣样本中的细菌，或者

　insilico设计的和数

　据库中有差异的序列。

　Note：推荐！马上要做16S测序了，来划个重点吧：

　记录并保存好所有实验中的原始数据研究方法不同时，比较需谨慎。

　尽可能从新鲜样本中提取DNA，或在相同的时间内用同样的方法保存样本。

　采用beatbeatingDNA提取方法可让细胞裂解更充分。

　参考文献选择适合的引物（注意：通用引物往往不通用！）对完全重叠的reads去冗余，使研究结果更接近真实微生物群落。

　在测序的每一个

　run里设置模拟微生物群落。

　在每个run中做一个只有试剂的阴性对照，进一步避免潜在误差。

　除此之外，最重要的是，良好的是实验设计，以及从样品制

　备一直到后期分析的方法一致性。

　/End.