补阳还五汤对Cav-1-/-小鼠脑缺血模型PI3K、Akt、PTEN表达的影响

陈博威 周胜强 易健 张文将 刘柏炎

摘要：目的  觀察补阳还五汤对Cav-1-/-小鼠脑缺血模型PI3K、Akt、PTEN表达的影响，探讨其可能的作用机制。方法  将野生型小鼠（WT）及Cav-1-/-小鼠（KO）随机分为假手术组、模型组与补阳组。采用大脑中动脉栓塞法制备脑缺血模型，干预10 d后运用Ayelet Levy 14分评分法观察小鼠神经功能评分。免疫组化和qRT-PCR分别检测小鼠脑组织PI3K、Akt、PTEN蛋白和mRNA的表达。结果  与假手术组比较，各模型组小鼠均出现明显神经功能障碍（P<0.01），且PI3K、Akt蛋白和mRNA表达明显升高（P<0.01），PTEN蛋白和mRNA表达明显降低（P<0.01），WT模型组小鼠脑组织PI3K、Akt、PTEN蛋白和mRNA表达更显著，且神经功能评分优于KO模型组（P<0.01，P<0.05）;WT补阳组小鼠脑组织PI3K、Akt、PTEN蛋白和mRNA的调控程度及神经功能恢复程度均优于WT模型组和KO补阳组（P<0.01）。结论  补阳还五汤可能通过Cav-1调控PI3K/Akt信号通路活性，发挥抗脑缺血损伤的作用。

关键词：补阳还五汤;脑缺血;PI3K/Akt信号通路;Cav-1基因敲除;小鼠

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2020）04-0035-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201910455

Effects of Buyang Huanwu Decoction on Expressions of PI3K， Akt， PTEN

in Cav-1-/- Mice after Cerebral Ischemia

CHEN Bowei1， ZHOU Shengqiang2， Yi Jian3， ZHANG Wenjiang1，4， LIU Baiyan1，4

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China;

2. Affiliated Hospital of Hunan Provincial Academy of Chinese Medicine， Changsha 410006， China;

3. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China;

4. Yiyang Medical College， Yiyang 413000， China

Abstract：
Objective To observe the effects of Buyang Huanwu Decoction on expressions of PI3K， Akt and PTEN after cerebral ischemia in Cav-1-/-mice; To discuss its possible mechanism. Methods Wild type mice （WT） and Cav-1-/-mice （KO） were randomly divided into sham-operation group， model group and Buyang Huanwu Decoction group. Cerebral ischemia model was established by middle cerebral artery occlusion. After 10 days of intervention， the neurological function scores of each group were observed by Ayelet Levy 14 points. Immunohistochemistry and qRT-PCR were used to detect the expressions of PI3K， Akt， PTEN protein and mRNA. Results Compared with sham-operation group， there were obvious neurological dysfunction in each model group （P<0.01）， and the expressions of PI3K， Akt protein and mRNA increased significantly （P<0.01）， PTEN protein and mRNA decreased significantly （P<0.01）. Besides， PI3K， Akt， PTEN proteins and mRNA expression in WT model group was more significant and the neurological function score was better than that of KO model group （P<0.01， P<0.05）. In addition， the degree of protein and mRNA regulation and neurological function recovery in WT Buyang Huanwu Decoction group was better than that in WT model group and KO Buyang Huanwu Decoction group （P<0.01）. Conclusion Buyang Huanwu Decoction may play an anti-cerebral ischemic injury role by regulating the activity of PI3K/Akt signaling pathway through Cav-1.

Keywords：
Buyang Huanwu Decoction; cerebral ischemia; PI3K/Akt signaling pathway; Cav-1 gene knockout; mice

缺血性脑血管疾病因其高发病率、高死亡率和高致残率给社会、家庭及个人带来沉重的痛苦和负担[1]。课题组前期研究发现，Cav-1在脑缺血损伤中可抑制炎症反应、降低缺血侧半暗带自噬及促进血管新生[2-4]，达到促进神经恢复的作用。PI3K/Akt信号通路是一条能调控细胞生长、分化及自噬的经典通路，对脑缺血损伤具有保护作用[5]。有研究表明，Cav-1可通过调控PI3K/Akt通路治疗疾病[6-7]，但Cav-1是否调控PI3K/Akt通路对脑缺血后脑保护作用产生影响，迄今未见报道。补阳还五汤为治疗缺血性中风气虚血瘀证的经典名方，其疗效已被临床证实[8]。本研究以Cav-1基因敲除小鼠作为研究对象，通过观察脑缺血小鼠神经功能评分与PI3K/Akt通路相关指标的蛋白与mRNA变化，探讨补阳还五汤干预脑缺血小鼠的作用机制。

1  實验材料

1.1  动物

健康雄性Cav-1-/-小鼠（KO）与同源野生型C57（WT）小鼠各40只。其中Cav-1-/-小鼠购自美国Jackson Laboratory，批号2909619，湖南中医药大学动物中心自行繁衍，均经PCR鉴定为Cav-1基因敲除[9]，自由摄食饮水。

1.2  药物

补阳还五汤（黄芪120 g，当归尾6 g，川芎3 g，红花3 g，赤芍4.5 g，桃仁3 g，地龙3 g），饮片购自湖南中医药大学第一附属医院。常规煎煮后浓缩至含2 g原药材/mL，冷藏备用。

1.3  主要试剂与仪器

PI3K抗体、Akt抗体、PTEN抗体、SABC-POD试剂盒（武汉博士德公司，批号依次为BA1353-1、BA1512、BM4114、SA1022）。EG1150H石蜡包埋机（德国莱卡公司），RM2235切片机（德国莱卡公司），BX71显微镜（日本奥林巴斯公司），TRIzol Reagent（美国Life Technologies公司），Rever tAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美国Thermo公司），PCR引物（上海生工合成），PCR扩增仪（美国Bio-Rad公司），核酸水平电泳仪（北京百晶生物技术有限公司），核酸蛋白浓度测定仪（英国BIO-DROP公司）。

2  实验方法

2.1  分组、造模与给药

将KO组和WT组按随机数字表法分为假手术组、模型组及补阳组，运用大脑中动脉栓塞法复制脑缺血模型，每组12只。将小鼠麻醉后固定，取颈正中切口，游离左侧颈总、颈内、颈外动脉，依次结扎颈总、颈外动脉。于颈总动脉分叉部下方0.2～0.3 cm处剪一小口，将鱼线通过颈总动脉，插入颈内动脉，遇轻微阻力后停止进线，深度（7.5±0.5）mm，固定鱼线并逐层缝合。假手术组仅切开皮肤、分离颈内、颈外动脉后即缝合。术后2 h参照Longa等[10]5分法进行神经功能评分。分值在1～3分表明造模成功，予以纳入研究。补阳组术后2 h给药，给药剂量为每日18.5 g/kg（按70 kg成人与动物体质量药量折算表换算）补阳还五汤药液，灌胃体积按0.2 mL/10 g体质量，模型组和假手术组动物均给予等体积蒸馏水。每日1次，连续10 d。

2.2  检测指标

2.2.1  神经功能评分

运用Ayelet Levy 14分评分法[11]评估神经功能。①提住尾巴将小鼠逐渐提高：前肢屈曲计1分，后肢屈曲计1分，30 s内头移动与纵轴形成角度>10°计1分;②将大鼠置于地面：正常爬行计0分，无法直线爬行计1分，沿患侧转圈计2分，患侧跌倒计3分;③梁平衡测试：静态姿势下可平衡计0分，抓握梁边计1分，抱住梁、有一肢体掉落计2分，抱住梁、有两肢体掉落，或在梁上旋转（>60 s）计3分，试图在梁上保持平衡但跌落（>40 s）计4分，试图在梁上保持平衡但跌落（>20 s）计5分，跌落且没有试图保持平衡或抓梁（<20 s）计6分;④反射缺失或异常动作：耳廓反射（当触耳道时摇头）计1分，角膜反射（用棉花丝轻触角膜可闭眼）计1分。

2.2.2  免疫组化检测蛋白表达

小鼠处死后，4%多聚甲醛固定大脑，脱水，常规包埋，切片，厚度约4 μm，依次烤片、脱蜡水化，3%过氧化氢去离子水灭活，热修复抗原，BSA封闭液封闭，适量一抗4 ℃冰箱过夜，PBS冲洗后二抗孵育，再次PBS冲洗，滴加SABC孵育，最后DAB显色并梯度脱水，透明，封片。每只大鼠取5张切片，光学显微镜（200倍）镜下观察，运行Image Pro Plus 6.0图像分析软件计算阳性细胞数。另因一抗特性不同，PTEN在DAB染色后再用苏木素复染，光学显微镜（200倍）镜下观察，运行ImagePro Plus6.0图像分析软件计算平均光密度。

2.2.3  qRT-PCR检测mRNA表达

从引物银行下载基因序列，用Primer premier 6.0进行引物设计，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。运用Trizol法提取脑组织总RNA;检测RNA浓度及质量;两步法反转录cDNA;PCR反应：预变性95 ℃、2 min，变性95 ℃、15 s，退火58.2～60.8 ℃，40个循环。溶解曲线反应程序：95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，温度缓慢上升（20 min）。β-actin为内参基因，用2-ΔΔCt进行相对定量，表示该基因相对表达量。ΔCt值=基因Ct值-内参Ct值，ΔΔCt值=实验组ΔCt值-对照组ΔCt值。

3  统计学方法

采用SPSS21.0统计软件及Graphpad Prism 8作图软件进行分析。计量资料以—x±s表示，符合正态性分布，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4  结果

4.1  补阳还五汤对模型小鼠神经功能的影响

假手术组小鼠无神经功能障碍;各模型组小鼠出现明显神经功能障碍（P<0.01），且KO比WT神经功能损伤更严重（P<0.05）;补阳组小鼠神经功能评分较模型组明显降低（P<0.05，P<0.01），但KO补阳组效果差于WT补阳组（P<0.01）。见表2。

4.2  补阳还五汤对模型小鼠PI3K、Akt、PTEN蛋白表达的影响

与假手术组比较，KO模型组较WT模型组小鼠PI3K、Akt蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.01），PTEN蛋白表达降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与KO比较，WT变化更显著（P<0.05，P<0.01）;與WT模型组比较，WT补阳组各蛋白表达变化更显著，差异有统计学意义（P<0.01），而KO补阳组调控程度不及WT补阳组，差异有统计学意义（P<0.01）。见图1～图6。

4.3  补阳还五汤对模型小鼠PI3K、Akt、PTEN mRNA表达的影响

与假手术组比较，KO模型组与WT模型组PI3K、Akt mRNA表达升高，差异有统计学意义（P<0.01），PTEN mRNA表达明显降低（P<0.01），与KO比较，WT变化更显著（P<0.05，P<0.01）。WT补阳组与WT模型组比较，各指标表达的变化更显著，差异有统计学意义（P<0.01），而KO补阳组调控程度不及WT补阳组，差异有统计学意义（P<0.01），与蛋白表达相似。见图7。

5  讨论

补阳还五汤由王清任所创，常用于治疗缺血性中风气虚血瘀之证。王氏认为元气藏于身体“气管之内，分布周身，左右各得一半”，中风后半身不遂是因元气亏损，则“经络自然空虚，有空虚之隙，难免其气向一边归并”，若元气只剩下五成，致元气归于半身而致对侧半身不遂。因此治疗上需补充亏损半身的五成元气。所谓“补阳”即补气，气为阳，“还五”即恢复半身亏损的元气，由此可保证全身元气十足，恢复偏瘫肢体。王氏指出“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀”，气虚血行不利，必导致血瘀。本方重用黄芪为君药，以大补元气;配以当归尾活血和血，为臣药;红花、桃仁、川芎、赤芍助当归活血祛瘀，地龙长于行散走窜，通经活络，均为佐药。诸药合用，使气旺促血行，活血而不伤正，则筋肉得养，痿废可愈。课题组前期研究表明，补阳还五汤能在脑缺血后通过降低炎症反应[12]、抑制细胞凋亡[13]、促进血管新生[4]、减少细胞自噬[14]等途径发挥抗脑缺血损伤作用。

PI3K/Akt通路是细胞一条关键的信号通路，广泛参与调控细胞增殖、分化及凋亡的各个过程[5]。脑缺血后机体受到刺激会释放各类酪氨酸激酶活性受体激活的物质，这些受体能特异性活化PI3K，当PI3K激活后，会将PIP2转化成PIP3，激活AKt。Akt作为一种重要的信息分子，不仅能继续激活下游哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号因子及B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）等调节细胞生长、自噬与凋亡[15]，还能通过减少肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β的释放减轻脑缺血后炎症损伤[16]。而PTEN能逆转PIP2向PIP3的转化，起到对整个通路的负性调控作用[17]。另有研究表明，PI3K/AKt信号通路还能在脑缺血后通过诱导神经再生[18]、抑制氧化应激[19]、促进血管新生[20]等方式，在脑缺血后恢复中扮演重要角色。本实验发现，脑缺血后小鼠PI3K、Akt的蛋白及mRNA表达上升，PTEN的蛋白及mRNA表达被抑制，但整体活化程度有限，无法完全修复受损神经，仍有明显神经功能缺损。补阳还五汤的干预使相关蛋白调控作用更明显，并能显著改善神经功能。我们推测补阳还五汤可能通过调控PI3K/Akt通路，发挥抗脑缺血损伤的作用。

小窝是一种特殊形式的脂筏，位于细胞膜表面的特异性凹陷区，在神经元及胶质细胞膜上有丰富的表达。Cav-1是小窝中重要的功能结构与核心蛋白，通过“脚手架结构区”可与下游各类效应因子结合，广泛参与细胞生长、分化、凋亡等病理生理过程[21]。课题组前期发现，Cav-1是治疗中风的潜在靶点：正常脑内有少量Cav-1表达，脑缺血后Cav-1迅速增加，Cav-1-/-小鼠脑梗死面积缩小速度明显低于正常小鼠，神经功能恢复也明显减缓[22];Cav-1敲除可降低缺血脑组织血管新生[4]及神经干细胞的增殖[23]。有研究表明，PI3K/Akt通路存在于小窝中并受到Cav-1的调控，抑制Cav-1可呈量效关系减弱Akt的活化[24]。也有研究表明，Cav-1能阻断PI3K/Akt通路来抑制胰腺癌的生长，并且Cav-1还可通过抑制神经酰胺的释放[25]，激活Akt信号通路，阻止细胞凋亡。据此，我们推测Cav-1可能通过调控PI3K/Akt通路发挥抗脑缺血的作用。本实验发现，补阳还五汤能改善脑缺血后的神经功能，其机制可能与调控PI3K/Akt通路有关。同时KO与WT比较，小鼠脑缺血后神经功能评分改善较低，PI3K/Akt通路相关因子表达受损，提示补阳还五汤可能是通过Cav-1调控PI3K/Akt信号通路的活性，促进神经恢复。

综上所述，本研究初步发现补阳还五汤可能通过Cav-1调控PI3K/Akt信号通路的活性发挥抗脑缺血损伤的作用，但目前尚无法确定其作用机制与PI3K/Akt信号通路上调相关。今后课题组将采取Cav-1基因敲除及PI3K/Akt抑制剂双重阻断Cav1/PI3K/Akt信号通路的方式，希望进一步明确补阳还五汤抗脑缺血损伤的作用机制。

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（收稿日期：2019-10-29）

（修回日期：2019-11-19;编辑：华强）

基金项目：国家自然科学基金（81273989）;湖南省自然科学基金（2018JJ2413）;湖南省中医药管理局项目（2015140）

通讯作者：刘柏炎，E-mail：[email protected]