宫颈癌患者治疗前后Tie-2和Ang-2的表达水平及其对预后的预测价值

任莹　丛玲华　何喻　方来福

[摘要] 目的 探討宫颈癌患者治疗前后Tie-2和Ang-2的表达水平及其对预后的预测价值。

方法 对2015年1月～2016年5月我院诊治的72例宫颈癌患者回顾性分析，并选择同时期、同年龄段的体检人群110例作为对照组，比较宫颈癌患者治疗前后Tie-2和Ang-2的表达水平，分析死亡与生存患者临床资料间的差异，应用多因素Cox回归模型探究影响宫颈癌患者预后的独立危险因素，并应用受试者工作特征曲线评估对预后的预测价值。结果 宫颈癌患者治疗前血清与组织Tie-2（P=0.000）的表达水平均显著高于对照组，宫颈癌患者治疗前血清Ang-2水平显著高于对照组（P=0.000）;治疗后，宫颈癌患者的血清Tie-2和Ang-2的表达水平显著低于治疗前（P=0.000， 0.002）。在为期24个月的随访中，共发生全因死亡31例，死亡组的临床分期（P=0.000）、治疗后血清Ang-2（P=0.000）和Tie-2水平（P=0.049）明显高于生存组。多因素Cox回归分析显示，治疗后Ang-2水平是影响宫颈癌患者预后的独立危险因素（P=0.000），临床分期Ⅱ期是宫颈癌患者预后的独立保护因素（P=0.006）。治疗后血清Ang-2水平预测宫颈癌患者预后的AUC明显高于临床分期和Tie-2（P=0.000），其最佳截点为≥1.22 ng/mL，敏感性和特异性分别为87.10%和92.68%。

结论 宫颈癌患者Tie-2和Ang-2的血清和组织表达水平较高，治疗后血清Ang-2水平是影响预后的独立危险因素，并对预后具有较高的预测价值。

[关键词] 血管生成素-2;Tie-2;宫颈癌;表达;预后

[中图分类号] R737.7          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）07-0006-05

Expression levels of Tie-2 and Ang-2 in patients with cervical cancer before and after treatment and their predictive value for prognosis

REN Ying   CONG Linghua   HE Yu   FANG Laifu

Department of Pathology， Yinzhou People"s Hospital of Ningbo City， Ningbo   315040， China

[Abstract] Objective To explore the expression levels of Tie-2 and Ang-2 in the patients with cervical cancer before and after treatment and their predictive value for prognosis. Methods Seventy-two patients with cervical cancer treated in our hospital from January 2015 to May 2016 were analyzed retrospectively， and 110 people of the same age receiving healthy checkup in the same period were selected as controls. The expression levels of Tie-2 and Ang-2 in the patients with cervical cancer before and after treatment were compared， and the differences in clinical date between the death and the survival patients were analyzed. The multivariate Cox regression model was applied to test the independent risk factors affecting the prognosis of patients with cervical cancer， and the receiver operating characteristic curve was applied to evaluate the predictive value for prognosis. Results The serum and tissue expression levels of Tie-2 （P=0.000） in  the patients with cervical cancer before treatment were significantly higher than those in the control group， and the serum Ang-2 level of the patients with cervical cancer before treatment was significantly higher than that in the control group（P=0.000）. The serum expression levels of Tie-2 and Ang-2 in the patients with cervical cancer after treatment were significantly decreased compared with those before treatment（P=0.000， 0.002）. During the 24-month follow-up， 31 all-cause deaths were detected. The clinical stage（P=0.000）， and post-treatment serum Ang-2 （P=0.000） and Tie-2（P=0.049） levels in the death group were significantly higher than those in the survival group. It was found by Multivariate Cox regression analysis that the Ang-2 level was an independent risk factor for the prognosis of the patients with cervical cancer after treatment（P=0.000） and that the clinical stage II was an independent protective factor for the prognosis of the patients with cervical cancer（P=0.006）. The AUC of the Ang-2 level predicting the prognosis of the patients with cervical cancer was significantly higher than that of the clinical stage and Tie-2 after treatment（P=0.000）， of which the optimal cut-off point was ≥1.22 ng/mL， and the sensitivity and specificity were 87.10% and 92.68%， respectively. Conclusion The serum and tissue expression levels of Tie-2 and Ang-2 in the patients with cervical cancer are relatively high. The serum Ang-2 level after treatment is an independent risk factor for prognosis and has a high predictive value for prognosis.

[Key words] Ang-2; Tie-2; Cervical cancer; Expression; Prognosis

宫颈癌是常见的女性生殖系统肿瘤，且随着性开放和社会发展，我国宫颈癌的发病率较以往明显升高。早期宫颈癌表现多不典型，患者就诊和确诊时多已失去手术指征，因而具有较高的病死率（每年全世界有26万人死于宫颈癌）[1]。新生血管的生成是肿瘤发生、发展和转移的主要机制之一，也是影响患者预后的重要因素，其中，影响血管生成的相关因子是目前肿瘤早期诊断、治疗和预后评估的研究热点[2]。研究发现，血管生成素-2（Angiogenin，Ang-2）及其酪氨酸受体Tie-2参与了血管生成和血管重塑过程，且在不同病情的宫颈癌患者中有不同表达水平，可能与治疗疗效和预后有一定的相关性[3]，但对于患者远期预后的预测价值尚不十分明确。为此，我院对72例宫颈癌患者进行了一项回顾性研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2015年1月～2016年5月我院诊治的宫颈癌患者，纳入标准：①临床及病理检查符合《宫颈癌诊断与治疗指南（第4版）》[4]中宫颈癌的诊断;②预后分期Ⅱ～Ⅳ期;③均于我院行宫颈癌根治术治疗及术后辅助化疗;④新发患者，无前期治疗干扰。排除标准：①无法耐受相关治疗而中途终止治疗的患者;②患者依从性较差，无法配合随访工作者。共纳入72例患者，年龄31～66岁，平均（53.13±4.09）岁，Ⅱ期18例，Ⅲ期41例，Ⅳ期13例;此外，选择110例经病理学检测排除恶性肿瘤的健康体检患者，两组患者的一般资料比较无统计学差异（P>0.05）。见表1。

1.2 治疗方案

根据《宫颈癌及癌前病变规范化诊疗指南》[5]，预后分期为Ⅱ～Ⅳ的宫颈癌患者均推荐行术后辅助化疗。其中，临床Ⅱ期患者行单纯FU类药物化疗;临床Ⅲ期实施以5-FU为基础联合铂类的方案化疗，Ⅳ期患者实施以5-FU联合铂类化疗联合治疗。

1.3 免疫组化检查

1.3.1 组织芯片制备  由高年资病理医师重判每例的HE切片，在相应癌组织和周围正常组织各取3个区域，取样针直径1.5 mm，设计7×8点阵，共56位点，组织芯间距3.0 mm。52℃恒温烤箱融蜡，4℃冰箱存放备用。

1.3.2 免疫组化检查  采用组织芯片系统（Quick-Ray，UT06，UNITMA，Korea）进行分析。组织芯片切片经二甲苯脱蜡、乙醇脱二甲苯、水化。加热pH6.0柠檬酸缓冲液至98℃并行抗原修复12 min后分别滴加一抗Tie-2（ab13585，美国Abcam）和Ang-2抗体（ab78106， Abcam，美国Abcam），二抗为通用型IgG抗体-HRP多聚体，室温或37℃孵育30 min。染色情况由2名高年资病理医师分别评估，表达量值由X-tile软件程序（Rimm Lab，Yale University，New Haven，CT，USA）进行定量测量。

1.3.3 血清学检查  分别于治疗前和治疗完成后抽患者的静脉血样3 mL，离心后取血清待测。将患者的血清样本统一标号，使用Ang-和Tie-2相应酶联免疫吸附法试剂盒（日本IBL生产，购自深圳科润达生物）及配套试剂，根据说明操作，将标准样品和测试样品使用自动酶标仪（雷杜RT-500）进行定量测定。

1.4 观察指标

比较宫颈癌患者治疗前后Tie-2和Ang-2的表达水平，分析预后良好与预后不佳患者临床资料间的差异，应用多因素Cox回归模型研究影响宫颈癌患者预后的独立危险因素，并应用受试者工作特征曲线评估对预后的预测价值。

1.5 随访

根据病案信息每2个月对患者进行一次随访，终点事件为全因死亡。随访时间为24个月，随访截止于2018年6月1日。预后不及定义为在随访期间死亡。

1.6 统计学方法

数据处理采用SPSS 25.0软件，计数资料以[n（%）]表示，分类变量的组间比较采用χ2检验，等级变量采用秩和检验;计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析，两组比较采用SNK法。多因素Cox回归分析探究危险因素，并采用Logrank检验计算风险比（Hazard ratio，HR）。当P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组和宫颈癌患者血清与组织Tie-2和Ang-2的表达水平比较

宫颈癌患者治疗前血清与组织Tie-2（t=9.288， 23.737，P=0.000）的表达水平均显著高于对照组，宫颈癌患者治疗前血清与组织Ang-2水平显著高于对照组（t=22.882、25.476，P=0.000）;治疗后，宫颈癌患者的血清Tie-2和Ang-2的表达水平显著低于治疗前（t=14.988、3.497，P=0.000、0.002），见表2。手术和放化疗后完全缓解的患者找不到病灶，故而无法取样和检测，因此未比较治疗后组织Ang-2和Tie-2表达水平。

2.2 宫颈癌不同预后患者的临床资料比较

在为期24个月的随访中，共发生全因死亡31例，死亡组的临床分期（Z=4.027，P=0.000）、治療后血清Ang-2（t=3.820，P=0.000）和Tie-2水平（t=2.030，P=0.049）明显高于生存组。见表3。

2.3 影响宫颈癌患者预后的多因素Cox回归分析

多因素Cox回归分析显示，治疗后Ang-2水平是影响宫颈癌患者预后的独立危险因素（HR=28.959，P=0.000），临床分期Ⅱ期是宫颈癌患者预后的独立保护因素（HR=0.174，P=0.006）。见表4。

2.4 不同指标预测宫颈癌患者预后的ROC曲线

应用治疗后血清Ang-2水平预测宫颈癌患者预后的AUC明显高于临床分期和Tie-2（Z=4.282，5.062， P=0.000，0.000），其最佳截点为≥1.22 ng/mL，敏感性和特异性分别为87.10%和92.68%，见图1、表5。

3 讨论

全球宫颈癌的发病率从1980年的37.8万例/年增加到2012年的52.8万例/年，我国是宫颈癌高发地区之一[6]。尽管基于宫颈细胞学和HPV检测的宫颈筛查方案可以有效降低宫颈癌的发病率，但由于患者社会、宗教和心理因素的影响，我国高危女性接受标准化筛查的比例还较低，导致较大比例的宫颈癌患者就诊时已出现周围或远处转移，生存情况和生活质量均较低[7]。血管的生成对肿瘤进展至关重要，血管生成相关的标志物在多种肿瘤中的高表达及其作用通路得到了大量研究证实[8]，并已显示出作为治疗中晚期的治疗靶标的巨大前景[9]。

人Ang及其受体Tie系统主要由三种分泌型配体（Ang-1、Ang-2和Ang-4）和两种酪氨酸激酶受体（Tie-1和Tie-2）组成[10]，以上三种Ang可以直接与Tie-2结合并导致Tie-2的磷酸化和多聚化，从而引发下游信号传导并调节血管重塑和成熟[11]。Ang-1和Ang-4广泛表达于人类静息脉管系统的内皮细胞，具有维持血管成熟和稳定的作用;而Ang-2在血管重塑和血管生成期间在内皮细胞中表达，并介导血管的重塑和外向型生长[12]。

本研究通过对72例宫颈癌患者及110例对照组宫颈组织和血清Ang-2與Tie-表达2水平进行分析，结果显示，与对照组相比，宫颈癌患者在治疗前后的组织和血清Ang-2与Tie-2水平明显升高，这显示，宫颈癌患者的肿瘤组织及外周血中存在较高的Ang-2与Tie-2表达。肿瘤的血管生成不仅涉及既往存在的血管生长，也与新生血管的出现等生理过程密切相关，这其中，血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和Ang-2等在内的影响血管生成的调节因素起到了重要作用[13]。目前基于VEGF的相关机制已有大量研究证实，其相关生物制剂也在临床治疗中得到了一定应用。与VEGF促进原有血管内皮生长的作用不同，血管生成素（Ang）家族在血管形成、成熟、修复和通透性的调节中均起到了重要作用，并且与癌细胞侵袭和转移密切相关[14]。作为Ang家族中作用效果最强的Ang-2，具有极强的破坏原有血管结构并增强内皮细胞对VEGF敏感性的作用[15]。还有研究显示，除了VEGF和Ang-2的共同表达促进了新的血管产生之外，Ang-2还可以在不依赖VEGF的条件下促进血管内皮细胞的迁移和增殖，从而促进血管重塑以及转移区域血管生成[16]，这一作用被认为与Ang-2与其血管内皮特异性酪氨酸受体Tie-2有关[17]。

而本研究还显示，治疗后宫颈癌患者的血清Ang-2与Tie-2表达水平均出现了显著下降，但仍高于对照组，可见手术联合化疗治疗可以较为明显地降低患者Ang-2及其受体Tie-2的表达水平，但患者治疗后仍有一定程度的高表达状态，这可能是患者发生远期转移和预后不良的重要因素。

通过对治疗后患者进行为期24个月的随访，共发生死亡事件31例，而对比死亡组与生存组患者的相关临床资料，结果显示，死亡组具有更高的临床分期和治疗后血清Ang-2水平，且多因素Cox回归分析显示，治疗后血清Ang-2水平是预后的独立危险因素，而Ⅱ期患者的预后明显优于其他患者。分析与Tie-2相比，Ang-2与治疗后预后具有更高的相关性的原因，可能与Ang-1/Ang-2表达平衡失调[18]，以及Ang-2可以通过与内皮细胞、间充质细胞和肿瘤细胞上的整联蛋白直接作用而发挥Tie-2非依赖性生物学效应有关[19]。

尽管目前宫颈癌相关手术和化疗研究已取得一定进展，但对于患者治疗后的预后评估尚无较好的定量指标。本研究通过应用ROC曲线对不同指标预测宫颈癌患者治疗后的生存情况进行分析，结果显示，治疗后血清Ang-2水平预测宫颈癌患者预后的AUC明显高于临床分期和Tie-2，以最佳截点（≥1.22 ng/mL）预测患者2年生存的敏感性和特异性分别为87.10%和92.68%。临床研究表明，肿瘤血管密度与各种实体瘤患者的不良预后之间存在直接相关性，而治疗后仍高表达的Ang-2可以加速新生血管生成，并促进残留肿瘤组织的生长、扩散和远处转移，这也为应用治疗后Ang-2水平预测预后提供了理论依据。这与Li P等[20]应用血清Ang-2水平预测乳腺癌患者预后的研究结论较为一致，而Diaz-Sanchez A等[21]使用血清Ang-2水平预测肝癌的侵袭力的研究也取得了较好的效果。

综上所述，宫颈癌患者Tie-2和Ang-2的血清和组织表达水平较高，治疗后血清Ang-2水平是影响宫颈癌患者预后的独立危险因素，并对患者的预后具有较高的预测价值。

[参考文献]

[1] 王临虹，赵更力.中国子宫颈癌综合防控指南[J].中国妇幼健康研究，2018，29（1）：1-3.

[2] Jayson GC，Kerbel R，Ellis LM，et al. Antiangiogenic therapy in oncology：Current status and future directions[J].Lancet，2016，388（10043）：518-529.

[3] Kerbel RS.A Decade of experience in developing preclinical models of advanced-or early-stage spontaneous metastasis to study antiangiogenic drugs，metronomic chemotherapy，and the tumor microenvironment[J]. Cancer J，2015，21（4）：274-283.

[4] 中國抗癌协会妇科肿瘤专业委员会.宫颈癌诊断与治疗指南（第四版）[J].中国实用妇科与产科杂志，2018， 34（5）：613-622.

[5] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.宫颈癌及癌前病变规范化诊疗指南（试行）[J].中国医学前沿杂志（电子版），2013，（8）：40-49.

[6] Ferlay J，Soerjomataram I，Dikshit R，et al.Cancer incidence and mortality worldwide：Sources，methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer，2015， 136（5）：E359-E386.

[7] 薛凤霞.子宫颈癌筛查和子宫颈病变的管理[J].中华医学信息导报，2018，33（8）：22.

[8] Hernández-Bartolomé ，López-Rodríguez R，Borque MJ，et al.Angiopoietin-2/angiopoietin-1 as non-invasive biomarker of cirrhosis in chronic hepatitis C[J].World J Gastroenterol，2016，22（44）：9744-9751.

[9] 龙行涛，周琦.局部晚期宫颈癌治疗现状与进展[J].中国实用妇科与产科杂志，2017，（11）：1206-1209.

[10] Eklund L，Saharinen P.Angiopoietin signaling in the vasculature[J]. Exp Cell Res，2013，319（9）：1271-1280.

[11] Biel NM，Siemann DW.Targeting the Angiopoietin-2/Tie-2 axis in conjunction with VEGF signal interference[J].Cancer Lett，2016，380（2）：525-533.

[12] Dewi NA，Aulanni"am A，Sujuti H，et al.Mechanism of retinal pericyte migration through Angiopoietin/Tie-2 signaling pathway on diabetic rats[J]. Int J Ophthalmol，2018，11（3）：375-381.

[13] Coelho AL，Araújo AM，Gomes MP，et al. Combined Ang-2 and VEGF serum levels：Holding hands as a new integral biomarker in non-small-cell lung cancers[J]. Future Oncol，2015，11（24）：3233-3242.

[14] Gadducci A，Lanfredini N，Sergiampietri C. Antiangiogenic agents in gynecological cancer：State of art and perspectives of clinical research[J]. Crit Rev Oncol Hematol，2015，96（1）：113-128.

[15] Scholz A，Plate KH，Reiss Y.Angiopoietin-2：A multifaceted cytokine that functions in both angiogenesis and inflammation[J].Ann N Y Acad Sci，2015，47（13）：45-51.

[16] Dong Z，Chen J，Yang X，et al.Ang-2 promotes lung cancer metastasis by increasing epithelial-mesenchymal transition[J].Oncotarget，2018，9（16）：12705-12717.

[17] Gerald D，Chintharlapalli S，Augustin HG，et al.Angiopoietin-2：An attractive target for improved antiangiogenic tumor therapy[J].Cancer Res，2013，73（6）：1649-1657.

[18] Yang P，Chen N，Yang D，et al. The ratio of serum Angiopoietin-1 to Angiopoietin-2 in patients with cervical cancer is a valuable diagnostic and prognostic biomarker[J].PeerJ，2017，5：e3387.

[19] Daly C，Eichten A，Castanaro C，et al. Angiopoietin-2 functions as a Tie2 agonist in tumor models，where it limits the effects of VEGF inhibition[J]. Cancer Res，2013， 73（1）：108-118.

[20] Li P，He Q，Luo C，et al. Diagnostic and prognostic potential of serum angiopoietin-2 expression in human breast cancer[J].Int J Clin Exp Pathol，2015，8（1）：660-664.

[21] Diaz-Sanchez A，Matilla A，Nu？觡ez O，et al. Serum angiopoietin-2 level as a predictor of tumor invasiveness in patients with hepatocellular carcinoma[J]. Scand J Gastroenterol，2013，48（3）：334-343.

（收稿日期：2019-07-29）